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Edição 142 > Garimpando a “matéria escura” microbiana

Garimpando a “matéria escura” microbiana

Criatividade e técnicas de sequenciamento genético dão um enorme impulso ao estudo de um universo de bactérias até recentemente desconhecido. Entre os resultados, o anúncio de uma nova versão da “árvore da vida” e a esperança de novos medicamentos

Convencionalmente, os biólogos estudam as bactérias isolando-as do ambiente e fazendo-as se reproduzir em meios de cultura enriquecidos com nutrientes. As bactérias cultivadas dessa forma são então usadas pelos cientistas para fazer seus experimentos. É evidente a vantagem de ter à mão um fornecimento constante do objeto de estudo e este método proporcionou, e continua proporcionando, um vasto conhecimento sobre as cerca de 10 mil espécies de bactérias que já foram descritas (dado de 2013). Seu sucesso, no entanto, teve um efeito colateral indesejável: deixou um enorme contingente de espécies microscópicas, constituídas de uma única célula, fora do alcance do olhar dos cientistas. E o motivo é simples: muitas bactérias não se reproduzem em laboratório. Estima-se que o número dessas espécies desconhecidas chegue à casa dos milhões; daí elas serem chamadas de “matéria escura” microbiana, numa referência à matéria prevista, mas desconhecida, que compõe a maior parte do Universo.
Novas técnicas de sequenciamento genético, desenvolvidas principalmente após o Projeto Genoma Humano, estão ajudando a identificar esse universo de organismos unicelulares que vivem nos mais diversos ambientes: no deserto, no gelo, no mar, em lagos, no mangue, no solo, nas raízes das plantas, no interior de outros organismos. 
O Projeto Genoma Humano finalizado em 2003, embora tenha frustrado a expectativa de revolucionar a produção de medicamentos, deixou como grande legado o barateamento e diversidade de técnicas de análise do conteúdo genético dos seres vivos. O sequenciamento de partes do material genético de qualquer tipo de ser vivo (unicelular ou multicelular), que anteriormente estava restrito a poucos laboratórios, tornou-se, desde então, uma prática rotineira em vários deles. E o sequenciamento do material genético completo dos organismos – o genoma – já deixou de ser tema de comemoração, como atestam as 30.500 espécies cujos genomas estão, atualmente, catalogados no banco de dados mantido pelo Departamento de Energia do governo norte-americano, que reúne genomas de seres vivos de todos os três domínios – Bacteria, Archaea e Eukarya – obtidos por cientistas de todo o mundo.
O estudo dos organismos que compõem a matéria escura microbiana, proporcionado pelas novas técnicas, está ajudando a entender desde aspectos teóricos da biologia – por exemplo, a composição do diagrama conhecido como “árvore da vida”, com consequências sobre o que conhecemos a respeito da origem da vida e dos mecanismos de evolução dos seres vivos – bem como a compreender novos aspectos da complexidade ecológica e a prospectar novos medicamentos, aditivos para a agricultura e biocombustíveis. Nesses microrganismos reside, inclusive, a esperança da descoberta de novas drogas capazes de enfrentar o aumento da resistência aos antibióticos, responsável pela elevação do número de mortes no mundo todo.

Lidando com dificuldades

Em um artigo publicado na revista científica inglesa Nature, em junho de 2015, a jornalista Corie Lok conta as desventuras do bacteriologista Robert Heinzen, no início da década de 1990, ao tentar reproduzir a bactéria Coxiella burnetii em laboratório. Na natureza, a C. burnetii vive como parasita e se reproduz em células de bovinos e caprinos, especialmente, mas também de gatos, cães e seres humanos. Ela provoca a Febre Q, uma doença parecida com a gripe influenza, e é notável por ter grande poder infeccioso – a infecção por uma única bactéria é suficiente para povoar o hospedeiro e deixá-lo doente. Daí o interesse em estudá-la.
Heinzen seguiu o procedimento convencional – isolou exemplares da bactéria do corpo dos animais infectados e experimentou vários meios de cultura diferentes na tentativa de conseguir que ela se reproduzisse –, e fracassou. O fracasso, no entanto, como é usual na atividade científica, transformou-se em um enorme ponto de interrogação, que deixou de importunar o cientista apenas em 2003, quando o genoma da C. burnetti foi sequenciado e deu a Heinzen novas esperanças. A análise dos genes da bactéria poderia fornecer, ao menos, pistas sobre o seu metabolismo e crescimento e ajudar a entender o que de tão especial era necessário para que ela se reproduzisse em laboratório.
Coube ao seu discípulo de pós-doutorado, Anders Omsland, o trabalho de comparar os genes que se expressam quando a bactéria está crescendo dentro das células do hospedeiro com aqueles que se expressam quando ela é forçada a viver fora de seu ambiente natural, ou seja, em cultura de laboratório. Foi um árduo trabalho ao longo de quatro anos.
Com o olhar voltado para descobrir quais nutrientes estavam faltando na cultura, Omsland chegou a apostar em um conjunto de genes relacionado à síntese de certa proteína que se expressava ativamente quando o parasita estava no hospedeiro, mas se mantinha quase inativo nas bactérias que sobreviviam no laboratório. Fornecendo certa quantidade de aminoácidos (moléculas essenciais para a produção de proteínas) no meio de cultura, ele conseguiu manter as bactérias isoladas vivas, mas elas nunca se reproduziram.
Osmand demorou a perceber que o vilão não era um nutriente, mas uma condição específica do ambiente onde vive tal bactéria. Ele havia observado um grupo de genes que sugeriam que C. burnetii é capaz de sobreviver em ambientes com baixo teor de oxigênio. “Quando os pesquisadores expuseram o micróbio a um ambiente com 5% de oxigênio ou menos, observaram, finalmente, ele se reproduzir”, conta a jornalista.
O resultado foi uma surpresa para toda a equipe. “Este foi um achado crítico. Não era um nutriente, era um fator ambiental”, disse Heinzen, que atualmente é pesquisador no Instituto Nacional de Alergia e Doenças Infecciosas norte-americano, onde chefia a seção dedicada ao estudo da Coxiella.
A descoberta possibilitou uma grande expansão das linhas de pesquisa com a bactéria. Já se conhece, por exemplo, como ela infecta as células do hospedeiro e, ali, se reproduz, e o laboratório de Heinzen, atualmente, está manipulando o genoma da bactéria para criar uma linhagem não virulenta, na esperança de que esse conhecimento seja útil para o desenvolvimento de vacinas.
Sequenciamento em massa

Enquanto algumas equipes de pesquisadores estão desenvolvendo dispositivos que facilitam a captura e o cultivo de bactérias da matéria escura (veja boxe Arapucas para bactérias), outras evitam as dificuldades que envolvem este tipo de empreendimento, cujo sucesso depende em grande medida de tentativa e erro, e apostam em procedimentos que permitem deduzir os genomas dos microrganismos sem ter que cultivá-los e, até mesmo, de capturá-los individualmente.
As técnicas de sequenciamento que prescindem da etapa de cultivo, que constituem a metagenômica, não são exatamente uma novidade. Desde meados da década de 1990, os pesquisadores estão sequenciando trechos do DNA e até o genoma completo de bactérias a partir de um único microrganismo, ou seja, uma única célula, coletada no ambiente.
Nos últimos dez anos, no entanto, com o barateamento dos processos de sequenciamento e a sofisticação de softwares e computadores, os pesquisadores não só estão aplicando esse método para centenas de indivíduos unicelulares coletados nos mais diversos ambientes, mas também desenvolveram uma espécie de sequenciamento em massa. O método consiste em extrair o DNA de toda a comunidade de bactérias presente em uma amostra, por exemplo, de solo. Esse DNA, que provém de vários microrganismos e está todo misturado é, então, fragmentado e os pedaços são sequenciados, revelando assim a ordem em que as “letras” do código genético (A, T, C e G, para o DNA) estão dispostas em cada fragmento. O resultado do sequenciamento é lançado em computadores que analisam cada um dos fragmentos e colocam-nos em sequência, reconstituindo os vários genomas dos microrganismos presentes na amostra.
Seria algo como ordenar as páginas de vários livros que tenham sido misturadas, imaginando que cada livro é um genoma e cada página um fragmento do DNA.
O procedimento ainda não é capaz de gerar genomas 100% completos, sempre faltam alguns trechos pequenos. Mesmo assim, a metagenômica proporcionou a descoberta de milhares de novas espécies de bactérias e, em muitos casos, rendeu estudos sobre o seu modo de vida e metabolismo, esclarecendo seu papel na comunidade do qual fazem parte e no ecossistema. Também já foram identificados vários genes cujos produtos têm interesse comercial. 

BOX
Arapucas para bactérias

Enquanto o sequenciamento do genoma já está automatizado e se tornou algo relativamente simples, capturar e cultivar as bactérias em laboratório é o desafio que algumas equipes de pesquisadores estão enfrentando com algum sucesso.
Um dispositivo que vem dando bons resultados é o chip microfluídico, desenvolvido pela equipe do russo Rustem Ismagilov, no Instituto de Tecnologia da Califórnia, em Passadena, e atualmente aplicado em diferentes tipos de pesquisa e exames laboratoriais. Essa espécie de arapuca para bactérias consiste de uma placa com milhares de minúsculos poços conectados por canais.
A equipe de Ismagilov usou um chip microfluídico que cabe na palma da mão e comporta 3.200 poços com volume na casa dos nanolitros, suficiente para abrigar apenas uma bactéria, no estudo de microrganismos que vivem no intestino humano realizado em seu laboratório. Os pesquisadores colheram amostras intestinais de um voluntário e preencheram os poços de 10 chips com a diluição obtida a partir das amostras. Cada chip, então, foi submetido a condições diferentes. Os vários poços de um mesmo chip capturaram diferentes bactérias e, em função das condições a que foi submetido cada chip, algumas delas cresceram outras não. Esse procedimento permitiu que se identificassem diferentes bactérias e as condições propícias para cultivá-las em laboratório.
Embora cada dispositivo tenha sido exposto a condições diferentes, em todos eles o fluido intestinal estava presente e, segundo os pesquisadores, esse foi o principal motivo do sucesso do experimento.
Pesquisas como essa, que envolve bactérias que vivem no corpo humano, foram estimuladas em 2012, quando um grupo de microbiologistas lançou para a comunidade de pesquisadores uma lista dos principais grupos de bactérias ainda por conhecer. O objetivo do chamado foi estimular estudos que viabilizassem o cultivo e sequenciamento do genoma de bactérias não cultiváveis relativamente comuns no corpo humano, com parentesco distante das já conhecidas.
Em resposta ao chamado, o engenheiro químico, Xiaoxia Nina Lin, da Universidade de Michigan, em Ann Arbor, está usando o chip microfluídico para estudar como as bactérias se relacionam entre si. Geralmente as bactérias vivem em comunidades complexas e, não raro, uma espécie é dependente de outras para sobreviver. Esse é outro fator que impede o cultivo delas quando isoladas em laboratório.
As dificuldades de obter as condições ideais de cultivo das bactérias em laboratório levaram uma dupla de microbiologistas à ideia de cultivá-las no próprio ambiente natural, onde vivem felizes. Slava Epstein e Kim Lewis, da Universidade do Nordeste, em Boston, desenvolveram, então, o iChip, um dispositivo para cultivar bactérias que vivem no solo. Ele é parecido ao chip microfluídico e tem o tamanho de um polegar. Possui 384 nanopoços que são preenchidos com uma mistura de solo e agar (uma gelatina obtida de algas e usada para cultivo de bactérias em laboratório), com a esperança de que, por conta do acaso, as bactérias do solo se alojem cada uma em um nanopoço. Aplica-se sobre o chip uma membrana que impede a saída das bactérias capturadas, mas permite a passagem de moléculas e, finalmente, enterra-se o dispositivo no solo de onde se retirou a amostra.
Esse dispositivo foi usado com sucesso pela dupla de pesquisadores em parceria com a NovoBiotic Pharmaceuticals, em Cambridge. Em um iChip que permaneceu no solo por um mês eles observaram colônias de 10 mil tipos de bactérias, um número muito maior do que aquele que obteriam se manipulassem a amostra de solo direto no laboratório. Eles, inclusive, identificaram uma nova espécie: a Eleftheria terrae.  

Revolução na árvore da vida

Já faz alguns anos que a microbiologista Jillian F. Banfield e sua equipe, da Universidade da Califórnia, coletam DNA dos mais variados ambientes – do solo dos campos da Califórnia até da água próxima às erupções vulcânicas que ocorrem no fundo do oceano – e submete-o à análise metagenômica. Como resultado, eles já haviam descoberto algumas centenas de novos microrganismos.
Recentemente, o grupo resolveu verificar como os novos achados contribuem para o desenho da árvore da vida, que ainda recebe esse nome embora seja apresentado nos mais diversos formatos. E, desde Darwin, é uma metáfora gráfica das relações de parentesco entre os seres vivos – os ramos da árvore representam os grupos que surgiram ao longo do tempo a partir de um grupo inicial, representado pelo tronco principal.
A equipe de Banfield analisou o DNA de 1.011 espécies que havia descoberto recentemente e outras 2.072 catalogadas no banco de dados metagenômicos do Departamento de Energia norte-americano. Os resultados foram divulgados em maio deste ano na revista Nature Microbiology.
Com a ajuda de um supercomputador, os pesquisadores obtiveram um vasto número de árvores possíveis, entre as quais escolheram a que contava com evidências significativas obtidas em outras análises. 
A revelação mais contundente dessa nova versão da árvore da vida é a enorme diversidade de grupos do domínio das bactérias quando comparado com os outros dois domínios: os eucariontes, do qual fazemos parte junto com todos os animais vertebrados e invertebrados, as plantas e os fungos; e com o das arqueas, organismos unicelulares e parecidos com as bactérias, mas geneticamente diferentes, e que vivem em ambientes extremos como mares e lagos muito salgados, fontes hidrotermais, locais ricos em gás sulfrídico e altas temperaturas.
Segundo o depoimento de Siu Mui Tsai, diretora e pesquisadora do Centro Nuclear da Agricultura (Cena) da Universidade de São Paulo (USP), à revista Pesquisa Fapesp em junho de 2014, a diversidade microbiana mal é conhecida e já se encontra ameaçada pelo desmatamento, queimadas, e substituição de matas nativas por pastagens e monoculturas. Um estudo realizado por sua equipe em uma fazenda em Rondônia constatou grande riqueza e abundância de espécies em áreas com vegetação nativa (floresta amazônica) em contraposição à homogeneidade de espécies em área de pastagem.
Ainda na nova versão da árvore da vida, o grupo de Banfield chama a atenção para um pequeno grupo de bactérias (à esquerda, em cinza, na ilustração) composto por organismos de tamanho muito reduzido e metabolismo muito simples. Segundo Banfield, esse grupo pode ser muito primitivo, quem sabe uma das formas de vida que surgiu no primeiro capítulo da história da vida na Terra e, bem adaptado, permanece entre nós.

Incentivos para a pesquisa

Em maio passado, a Casa Branca anunciou um projeto de investimentos privados e governamentais para incentivar a pesquisa da matéria escura microbiana. A Iniciativa Nacional para o Microbioma pretende destinar US$ 121 milhões para mapear e investigar os microrganismos que vivem no corpo humano e nos diferentes ecossistemas, que deverão ser custeados por várias agências federais, como o Departamento de Agricultura, os Institutos Nacionais de Saúde e o Departamento de Energia.
Investidores privados deverão destinar mais US$ 400 milhões ao longo de vários anos. A Fundação Bill & Melinda Gates, por exemplo, pretende participar da iniciativa com US$ 100 milhões, parcelados em 4 anos, para programas de pesquisa em nutrição e controle de pestes em países em desenvolvimento. Outras parceiras da iniciativa destinarão seus recursos para a pesquisa do tratamento de doenças como o câncer e da microbiologia marinha.
Em seu comentário na revista Nature, a jornalista Sara Reardon ressaltou, no entanto, que o projeto da Casa Branca ainda deve passar por desafios não muito animadores: dificilmente ele será aprovado pelo atual Congresso norte-americano, controlado pelos Republicanos, que geralmente não apoiam as inciativas do presidente Barack Obama.
Também não há otimismo em relação à participação da indústria farmacêutica na prospecção de bactérias não cultiváveis que produzem substâncias de interesse farmacológico, especialmente antibióticos. O bioquímico Gerry Wright, da Universidade MacMaster, em Hamilton, no Canadá, até concorda que as pesquisas devem focar em genes e grupos de genes do solo e do ambiente marinho ao invés de no corpo humano, no entanto ele afirmou à jornalista Corie Lok da Nature: “Apenas olhando para uma molécula, é praticamente impossível dizer se ela poderá ser útil como um medicamento”. E, acrescenta a jornalista, “até mesmo se ela aparenta ser promissora, as barreiras que existem para comercializar um novo antibiótico são grandes”.
Esse é o tom também da revista inglesa The Economist, da última semana de maio. Sob o título de capa “Quando as drogas não funcionam: o aumento da resistência aos antibióticos”, o artigo afirma que a indústria farmacêutica não tem interesse em pesquisar remédios para doenças agudas, muitas das quais tratadas com antibióticos, por exemplo. Elas investem em tratamento de doenças crônicas, cujos remédios são consumidos pelos pacientes por longos períodos, tempo suficiente para darem o retorno financeiro que elas almejam.
O microbiologista Tim Lewis, que participou da pesquisa que levou à descoberta da bactéria Eleftheria terrae, no entanto, acredita que a metagenômica de última geração contribuirá para a descoberta de uma nova leva de medicamentos e antibióticos. E não é para menos, ele descobriu que a E. terrae produz um antibiótico, o teixobactin, que em estudos de laboratório se mostrou letal a vários micróbios patogênicos aos seres humanos, inclusive a linhagens resistentes da bactéria Staphylococcus aureous, que já não respondem aos antibióticos atuais. E como se não bastasse, Lewis descobriu que as bactérias patogênicas não desenvolvem resistência ao teixobactin porque ele “imobiliza” moléculas importantes para a vida da bactéria, assim, as modificações que poderiam evitar os efeitos do antibiótico apenas prejudicam a existência dessas bactérias.
Na opinião de Lewis, iniciou-se um período similar ao que ocorreu entre as décadas de 1940 e 1950, quando o microbiologista Selman Waksman descobriu mais de 20 antibióticos ao investigar bactérias do solo capazes de bloquear o crescimento de outras bactérias. Em 1953, Waksman recebeu o Nobel de fisiologia ou medicina pela descoberta da estreptomicina, o primeiro antibiótico efetivo contra a tuberculose. Mais de sessenta anos depois, a Mycobacterium tuberculosis, que provoca a doença, está entre as que representam alto risco, pois existem linhagens que desenvolveram resistência a drogas, e ela já não responde aos efeitos da estreptomicina.
No Brasil, o Projeto Microbioma Brasileiro foi lançado em 2014 com o objetivo de dimensionar a diversidade de microrganismos do país e reúne pesquisadores de vários centros de pesquisa.

*Verônica Bercht é bióloga e editora de Ciências. Contato: vbercht@gmail.com